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【专题讨论】新手做WB的几张片子请各位高人指点。

发布日期:2020-06-28 02:51   来源:未知   阅读:

  我是一个门外汉,刚刚做WB。做出来后全是模糊的片子,还有就是只有黑点,没有条带。一直没找到原因。恳请各位高人教导。并且按照以下的方法做。我做的是SD大鼠骨骼肌组织的蛋白检测,取300mg肌肉,最终加2.4ML裂解液。10000转离心10分钟。定蛋白也是按一下方法。上样按每10微升80微克蛋白上的样。用的是大连竞迈公司的垂直电泳仪。装模是半干法,按没分钟1KD转的。一抗1:1000.二抗1:6000。。 我测的蛋白在95KD左右,一半装2-2.5小时。但是结果不是背景强就是没东西。而且经常有黑点。

  组织称重,切碎,以每克组织加3ml RIPA裂解液,冰上以匀浆器匀浆,转到小离心管中,冰上放置40分钟,使其蛋白质充分裂解。4?C ,10000rpm,离心10min,取上清,转入小tube管中,-20 ℃贮存备用。

  Bradford法定蛋白的原理:考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1 000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

  考马斯亮蓝G-250染液的配制:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL 90%乙醇中,加入85%(W/V)的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。

  采用Bradfold法进行蛋白定量,以1 mg/mlBSA 制作标准曲线ml三蒸水),按下表配置梯度浓度的标准溶液。

  其次,将以上浓度的标准溶液依次加入96孔板中,每孔加40ul,制作平行孔。之后,将样品上清液用1×PBS稀释50倍(或100倍),混匀,以每孔40ul加入上述96孔板中,制作平行孔。

  根据不同浓度BSA在595 nm的不同的紫外光吸光值,用酶标仪测定样品在595 nm处的吸光值,用excel求出一元线性回归方程(y=kx+b),其中y是吸光值,x是测定的样品上清液的浓度,求出样品浓度(x值(ug/ul))。

  电泳凝胶:丙烯酰胺29.2 g,N, N-亚甲基双丙烯酰胺0.8 g,加三蒸水溶解,定容至100 ml,过滤后4℃备用。

  制胶用夹子夹好垂直电泳板,固定在电泳架上,先用蒸馏水检测一下是否漏水,将梳子放入玻璃板中,在距梳子的下缘1.5-2cm(浓缩胶的宽度)的地方画一条线;之后按下列配方配制分离胶,混匀,用20ml注射器注入电泳板缝,加之线的高度即可(分离胶的宽度)中,立即用酒精压平分离胶的上平面,使其成为一条线小时待其凝固后,制备浓缩胶,移入玻璃板中,立即将梳子放入浓缩胶中,凝固0.5小时。

  每孔加样50-100 μg蛋白质,根据样品上清液浓度,计算每孔中蛋白质样品的体积,补1×PBS使体积为15μl,再向每个样品管中加5 μl 4×样品缓冲液,一切操作均在冰上进行。混匀后沸水浴3-5分钟,-20?C备用。

  上样、电泳将制好的胶放在电泳槽中,加满电泳缓冲液,轻轻拔掉梳子,用微量进样器加入处理好的蛋白质样品,左侧第一个孔道为蛋白Marker,依次在各个孔道中加入样品,并做好顺序记录。安装好系统后,4?C、220V电压下开始电泳,使蛋白质样品首先在浓缩胶中压缩成一条细带,然后继续电泳,直至样品指示剂-溴酚蓝到达玻璃板的下缘,关掉电源,取下制胶板,用刀片或镊子将两块玻璃板轻轻撬开,用单面刀片将浓缩胶切掉,将分离胶左上方切掉一个小角以标记样品顺序。(由于分离胶非常容易断裂,因此在移动前手需要保持湿润,也可在胶上滴加一些三蒸水。)

  原理:蛋白质样本和生物素标记的蛋白marker标准经SDS-PAGE后转于印迹膜上,然后经一抗→HRP 标记的二抗→HRP催化LumiGLO

  ×PBS加Tween20,使Tween20的浓度为0.1%。封闭剂(5%脱脂奶粉):2g脱脂奶粉,40 ml PBST缓冲液,振荡混匀,4℃备用,可重复使用1次。

  先将PVDF膜放在甲醇中平衡1分钟后(如果硝酸纤维素膜则不需要在甲醇中平衡1分钟),再放到1×的转移平衡液中平衡5分钟。将8层滤纸放在1×的转移平衡液中平衡5分钟。将电泳后的分离胶放到三蒸水中平衡1-5分钟(时间尽量短)。

  转膜仪的下面是阳极,依次放置已经在转移平衡液中平衡过的(顺序由下至上)4层滤纸、PVDF膜、电泳凝胶、4层滤纸(每放置一层需要用玻璃棒赶尽气泡,用滤纸将周围的液体吸干,注意千万不能将胶小于滤纸,否则将会导致短路)。在PVDF膜的左上角用铅笔标记样品顺序。在转移夹层的顶部放置阴极电极。接通电源,室温、220V转移25-30分钟。转移后的凝胶放到考马斯亮蓝R-250中染色,无明显条带显示表明转移效果较满意。

  封闭在25℃条件下,PVDF膜放入封闭液中(封闭好,以防液体挥发),以每分钟60转恒温摇床上振荡60分钟。

  一抗结合依据抗体说明书的有效浓度,使用PBST和封闭液(1:1)来配置一抗,混合均匀。(例如膜为4×7.5cm2

  将PVDF膜放在一抗中。4?C孵育过夜(抗体的体积至少要覆盖膜表面,防止干燥。)。 一抗可回收再次使用(如连续使用放置4?C,否则放置-20?C)。

  洗去一抗:25℃条件下,摇床转速为75转/分钟,用PBST洗膜3次,每次在恒温摇床上振荡10分钟。

  二抗结合加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或抗鼠IgG (1:3000,制备时封闭液和PBST的比例为1:1),37℃,60转/分钟,在恒温摇床上振荡60分钟。

  洗去二抗:25℃条件下,摇床转速为75转/分钟,用PBST洗膜3次,每次在恒温摇床上振荡10分钟。之后用PBS洗膜10分钟。

  显色利用化学发光的原理,ECL Western印迹系统使得快速高灵敏度检测蛋白成为可能。在ECL Western印迹系统中,目的蛋白是通过辣根过氧化物酶偶联的抗体进行检测,检测反应的底物Lnminol在辣根过氧化物酶的作用下发生氧化化学发光反应,所发光在增强剂作用下,强度提高了1000倍,用感光胶片记录发光的位置和强度。?

  在平底容器(如香皂盒)中等体积加ECL试剂盒中1溶液和2溶液,混匀(注意避免光线直射)。PVDF膜放入平底容器中,将混匀好好的ECL溶液加到PVDF膜上,使液体和膜充分接触,轻摇5分钟。取出膜,吸干多余液体,然后将PVDF膜放在保鲜膜上包好(蛋白质面朝上),用玻璃棒赶尽所有的气泡和褶皱,放入暗盒中,剩下操作在暗室中进行。暗室对X射线分钟,之后放入定影夜1-3分钟,自来水冲洗,晾干后观察,计算机定量扫描处理。